分析mRNA 稳定性

由于 mRNA 的完整性和纯度对于保障 mRNA 疫苗的有效性和安全性至关重要，因此拥有监测这方面的工具非常重要。mRNA分子的各种属性共同决定了产品是否可以正常发挥作用。Poveda等人的综述重点介绍了这些属性，并简要介绍了通常用于评价和监控它们的方法。

表3提供了完整的分析评价方法列表，用于确定和监测 mRNA 疫苗原料药和终药品的质量属性和稳定性。目前在公开资料中仍然无法获得已获批使用的mRNA-LNP疫苗产品的质量标准，泄露的相关文件中提到mRNA 完整性的百分比应在70% 到 75% 之间，EMA 的评估报告写道：“在当前大流行的紧急情况下提交的这种医药产品的质量被认为是足够一致和可接受的。"

表3 测定和监测 mRNA 原料药和 mRNA-LNP产品质量属性和稳定性。

缩写：AF4，非对称流场-流分馏；AFM，原子力显微镜；dsDNA，双链 DNA；DLS，动态光散射；ESEM，环境扫描电子显微镜；IEX-HPLC，离子交换高效液相色谱；IP-HPLC，离子对高效液相色谱；MALS，多角度光散射；NTA ，纳米粒子追踪分析；qPCR，定量聚合酶链反应；RP-HPLC，反相高效液相色谱；SE-HPLC，体积排阻高效液相色谱；TEM，透射电子显微镜；TRPS，可调电阻脉冲感应。

在这里，我们详细介绍了适用于研究 mRNA 完整性和用于质量控制 (QC) 的技术。Schmidt 概述了欧盟当局要求的以 mRNA 疫苗为重点的研究药品档案 (IMPD) 的质量文件，感兴趣的读者可以参考该信息性文件了解详细信息。由于许多描述的方法旨在检测裸露的 mRNA，而mRNA 疫苗包封在 LNP中，因此对于某些检测，首先需要从LNP 中释放出mRNA，可以通过适当的控制来考虑此过程的潜在影响。

凝胶电泳是一种常用的技术，可以提供有关 mRNA 大小和完整性的信息。当 mRNA 降解并发生链断裂时，mRNA 链变短。因此，预期 mRNA 长度处的条带强度会降低或条带会变宽，同时可能会出现新的条带。

Démoulins等人使用凝胶电泳法分析了在无RNase 条件下SAM 的质量。根据凝胶电泳数据，他们能够确定 mRNA 是否具有可接受的质量和稳定性，目前已研发出商用电泳设备用于 mRNA 的高通量分析。

张等人报道了荧光相关光谱 (FCS) 可用于监测 mRNA 大小的变化，主要原理是通过荧光标记的mRNA 的布朗运动来计算分子量。然而，这种技术需要荧光标记，与凝胶电泳相比准确度并不一定更高，并且只能检测到包括分子量发生变化的mRNA 降解，例如链断裂等。

在整个（生物）制药行业，色谱技术形成了一个强大的平台来监测药物的纯度和稳定性。然而，迄今为止，用于确定 mRNA 分子纯度和稳定性的HPLC技术的开发进展缓慢。分析大 分子mRNA的成功方案可以在文献以及阐述 RP-HPLC、SE-HPLC、IP-HPLC 和 IEX-HPLC 方法的文献中找到，其中一些技术也可用于mRNA 制备纯化。IEX-HPLC 可用于测量游离和LNP 包封的 mRNA。前面提到的RiboGreen技术可以建立相同参数的正交技术，然而使用相同的mRNA-LNP样品却测定出了不同的含量结果；与RiboGreen 数据相比，IEX-HPLC 结果与体内数据的相关性更好。这说明即使是像 RiboGreen 检测这样的成熟技术，也应该根据具体情况进行详细验证。

mRNA 降解也可以通过RT-qPCR进行分析，使用方法可以测定能转录成完整目标cDNA的mRNA 总量，这表明所有影响这个过程的因素都可以间接定量检测。Brisco 和 Morley对 RT-qPCR技术进行评估，认为它的定量结果是可靠的。RT-qPCR技术的另一个优点是能定量检测影响转录的所有类型的降解，而之前讨论的其它技术只能检测mRNA 的大小。然而，，RT-qPCR 技术也有一定的局限性，由于所用酶存在错误率，导致结果有时不太可靠。而且RT-qPCR 技术这目前没有被广使用，并且无法区分不同类型的降解。

mRNA体外（细胞内）表达也用于分析mRNA的完整性，通过使用编码荧光蛋白的mRNA，可以通过测量荧光信号间接确定mRNA 的完整性。这种方法有助于为生物活性 mRNA-LNP 设计和chu方筛选研究提供指导。或者，可以使用酶联免疫吸附试验 (ELISA) 或蛋白质印迹技术（WB）来确定编码非荧光抗原的mRNA 的翻译功效。这种方法的优点是它给出了制剂的整体完整性和可能影响 mRNA 转录的所有因素的总和。这种方法的局限性是不是很精确，无法明确mRNA破坏的类型，并且耗时。